流通池法测定曲安奈德益康唑乳膏释放度的方法研究

流式细胞法测定曲安奈德益康唑乳膏释放度的研究

概括

目的建立测定曲安奈德和益康唑乳膏两种活性成分释放度的流式细胞法。

方法采用流动池法，采用封闭系统装置测定曲安奈德益康唑乳膏的释放度。 分别考察释放介质、放置方式、流速和半透膜孔径对两种活性成分体外释放曲线的影响。 对两种生产方法进行了比较。 公司市售产品体外释放行为的差异； 采用HPLC测定释放量，采用Luna C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脱，检测波长227 nm，柱温40℃，流速1.0 mL/min，进样量100 μL 。

结果：以含0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化钠溶液为释放介质，温度为（32±0.5）℃，​​流速为16 mL/min，半固体接头孔径半透膜为2.7μm，过滤器为0.45μm混合纤维素膜，可以获得既有效又具有一定区分度的释放曲线。 曲安奈德在0.0052~0.7803 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系(r=0.9994)，硝酸益康唑在0.0552~8.2851 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系(r=0.9993)。 两个厂家的体外释放曲线存在显着差异，活性成分的粒径可能是影响释放行为差异的主要因素之一。

结论：该方法准确度好、灵敏度高，可用于曲安奈德和益康唑乳膏释放度的检查。 对于优化处方和生产工艺具有重要意义，有利于促进企业一致性评价。

关键词

01 简介

药品审评中心（CDE）于2021年3月发布《皮肤外用化学药品仿制药研究技术指导原则（试行）》，指出对于含复配物的软膏剂、乳膏剂、凝胶剂等半固体制剂，处方组合物，由于其具有多相和热力学不稳定的特点。 体外释放的程度和速度会影响制剂的质量和性能。 应进行体外释放试验。 但国内体外释放试验条件和操作方法仍缺乏明确的指导原则。 指出，建议参考国内外相关文献和指导原则开展相关研究工作。 2021年版美国药典通则提供了半固体剂型的体外释放测量装置，包括垂直扩散池（VDC）和流动池方法。 早在1996年，他们就提出可以采用流动池法来研究半固体制剂的体外释放。 与垂直扩散池相比，流动池法更具判别力，可以避免气泡对测量结果的影响。 流槽法早已被国外多部药典收载。 《中国药典》2020年四卷增补了第六种方法——流式细胞法。近期国内有文献报道流式细胞法用于贴剂、半固体等特殊制剂体外释放度的测定准备工作。 控制提供了一种新的评价方法，但目前应用较少，方法不成熟。

曲安奈德益康唑乳膏是公司研制的复方乳膏。 规格为每克含硝酸益康唑10毫克，曲安奈德1毫克。 其销售国家为英国和法国。 商品名称为®/®。 原创研究成果不引进。 销售方面，国内有16家生产企业。 初步研究结果显示国产产品（商品名：®）、国内仿制药代表产品（商品名：®）及原研产品的处方组成（Q1）、处方用量（Q2）、微观结构特征（Q3） ）是完全不同的。 李珍等. 采用垂直扩散池研究不同厂家曲安奈德和益康唑乳膏的体外透皮吸收试验。 但目前尚未见利用流动池法对该产品进行体外释放的报道。 本文旨在建立流式细胞法测定体外释放，从而研究Q3对体外释放行为差异的影响，从而指导该产品的一致性评价研究，并为免除生物等效性研究提供研究依据。

02 测试材料

2.1 测试仪器

流通池（推荐华荣DS-7CP流通池溶出系统）； 3000高效液相色谱仪( ，美国)； XP 205 1/100,000 电子天平（梅特勒-托利多）。

2.2 药品和试剂

曲安奈德益康唑乳膏（商品名：®，批号）购自A厂； 曲安奈德益康唑乳膏（商品名：邦力®，批号）购自B厂； 曲安奈德对照品（批号-）、硝酸益康唑对照品（批号-）购自中国食品药品检定研究院，质量分数>98%； 己磺酸钠购自百色林化工科技有限公司； 磷酸、四氢呋喃和四氢呋喃丁基氢氧化铵购自成都科隆化工有限公司； 色谱纯乙腈、异丙醇、甲醇购自安徽世联特种溶剂有限公司。

03方法

3.1 体外释放测定方法

3.1.1 色谱条件

以辛基硅烷键合硅胶为填料（Luna C8，250 mm×4.6 mm，5 μm），[取0.94 g己烷磺酸钠，加入乙腈-异丙醇-水-85%磷酸（140:140:720:1） ），溶解并稀释至1000 mL]作为流动相A，用[取0.94 g己磺酸钠，加甲醇-水-85%磷酸（900:100:1），溶解并稀释至1000 mL]进行流动B相，按表1梯度洗脱； 检测波长227 nm； 柱温40℃； 流速1.0毫升/分钟； 进样量100μL。

表1 梯度洗脱程序

3.1.2 发布条件

照溶出度和释放度测定法（中国药典第四部通则0931第六法，2020年版）测定。 采用流通池法关闭系统装置（释放测试流通池见图1）。 取本品约0.1 g，均匀涂布于孔径2.7 μm的半透膜上，置于半固体适配器（规格：1.2 mL）中。 将其放入内径为22.6 mm的标准片剂池中（半透膜朝下），用200 mL含0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化钠溶液作为释放介质，温度为（32± 0.5)℃，流速16 mL/min，脉冲120，0、2、4、8、12、18、24、30 h采样1.5 mL。

图1 释放测试流通池

3.1.3 溶液的制备

以“3.1.2”项下的释放液作为供试品溶液。 精密称取曲安奈德对照品约10 mg，置于10 mL容量瓶中。 用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。 以此作为曲安奈德对照品储存液。 另取硝酸益康唑对照品 10 mg，置于 20 mL 容量瓶中。 精密加入曲安奈德对照品储备液1 mL，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀； 准确量取1mL，置于100mL容量瓶中，用释放介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

3.2 体外释放的方法学验证

3.2.1 特异性测试

取本品约0.1 g，按“2.1.2”操作，30小时后取样1.5 mL，作为供试品溶液。 另取曲安奈德对照品、硝酸益康唑对照品适量，按“2.1.3”制备对照品溶液。 取上述溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图（图2）。 结果表明，在此色谱条件下，曲安奈德和硝酸益康唑与相邻色谱峰分离良好，溶剂峰不干扰测定。

3.2.2 精度测试

取对照品溶液100 μL，按“2.1.1”中的色谱条件连续进样6个，记录色谱图，计算两个主成分峰面积的相对标准偏差。 结果是曲安奈德和硝酸益康唑峰面积的 RSD。 分别为0.5%和0.2%，精度较好。

3.2.3 线性关系考察

取曲安奈德、硝酸益康唑对照品适量，加甲醇适量溶解，加释放介质稀释，制成系列对照品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。 以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。 结果表明：曲安奈德在0.0052~0.7803 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，回归方程A=2.3944C+0.0167，相关系数为0.9994； 硝酸益康唑在0.0552~8.2851 μg/mL浓度范围内线性良好，回归方程 A=4.1645C+0.1606，相关系数0.9993。

图2 典型的特异性谱

3.2.4 回收率测试

取本品约0.05g，精密称定，置于200mL量瓶中，平行做9份。 另取各对照品适量，精密称定，用甲醇适量溶解，用缓释介质定量稀释，制成含曲安奈德约10μg、益康唑100μg的混合溶液。每1 mL 硝酸盐，作为对照品储备。 解决方案。 精密量取对照品储备液 4、5、7 mL 各 3 份，置于上述 9 个容量瓶中，用缓释介质稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 滤膜过滤，取继续滤液，测试溶液的回收率为80%、100%和140%。 取本品约0.1 g，置于200 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，用释放介质稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为测试溶液。 按“2.1.1”中的色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率。 结果表明，曲安奈德和硝酸益康唑的平均回收率分别为99.7%和99.8%，RSD分别为1.4%和1.1%（n=9）。

3.2.5 溶液稳定性

取本品约0.1 g，按“2.1.2”操作，30小时后取样1.5 mL，作为供试品溶液。 按“2.1.1”中的色谱条件测定，分别于0、8、12、24、72 h时注入液相色谱仪，记录色谱图。 计算两种主要成分峰面积的相对标准偏差。 结果表明，曲安奈德和硝酸益康唑峰面积的RSD分别为0.3%和0.5%，表明溶液在72 h内具有良好的稳定性。

3.2.6 溶液稳定性

取“2.2.3”项下溶液，逐级稀释，注入液相色谱仪，依法测定，记录色谱图。 使用信噪比S/N=3:1计算检出限，使用信噪比S/N=10:1计算定量限。 检出限为：曲安奈德0.94 ng/mL，硝酸益康唑0.45 ng/mL； 定量限为：曲安奈德 3.15 ng/mL，硝酸益康唑 1.50 ng/mL。

3.3 释放测量条件的确定

3.3.1 脱模介质的选择

该产品局部施用于皮肤。 皮肤的pH值约为5.0，呈弱酸性。 因此，本研究选择pH 4.5醋酸盐缓冲液、pH 5.5醋酸盐缓冲液和0.0015 mol/L磷酸溶液。 和0.9%氯化钠溶液，共4种溶液，考察曲安奈德和硝酸益康唑在不含表面活性剂和含有表面活性剂的释放介质中的溶解度。 取曲安奈德约10mg、硝酸益康唑约20mg，精密称定，分别加入释放介质10mL（表2）。 温度25℃，以200r/min连续搅拌24h，取出，冷却至室温，离心，取上清液，按“2.1.1”色谱条件测定，记录色谱图，并计算溶解度。 本品规格为每1g含曲安奈德1mg，硝酸益康唑10mg。 结果表明（表3~4）曲安奈德为含0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化物溶液。 在钠溶液中溶解度最高； 硝酸益康唑在0.9%氯化钠溶液中的饱和溶解度明显高于其他三种介质。 根据本品的用法用量，早晚各一次给药。 结合前期不同剂量的释放曲线研究结果，两种有效成分的释放时间过长，不利于缩短评价时间。 综上所述，初步选择含有0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化钠溶液作为释放介质。

表2 释放介质的组成

表3 曲安奈德在不同溶出介质中的溶解度(mg/mL)

表4 硝酸益康唑在不同溶出介质中的溶解度(mg/mL)

3.3.2 放置方式的选择

照溶出度和释放度测定法（中国药典第四部通则0931第六法，2020年版）测定。 使用流通池方法关闭系统设备。 取本品约0.1克。 加载方法如表5所示。使用200 mL含0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化钠溶液作为释放介质。 温度为（32±0.5）℃，​​活塞泵流量为8 mL/min，脉冲为120。0、2、4、8、12、18、24、30、36、42时样品1.5 mL分别放置48小时和48小时，取溶液按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算释放量。 绘制释放曲线，研究加载方式对释放的影响。 结果如图4~5所示。 结果表明，半固体接头加载法虽然比标准池直接加载法释放慢，但RSD值更小，重复性更好。 因此，初步确定半固体适配器作为释放测量的加载方法。

3.3.3 流量选择

照溶出度和释放度测定法（中国药典第四部通则0931第六法，2020年版）测定。 采用流通池法关闭系统装置，取本品约0.1g，均匀涂抹于玻璃纤维膜（孔径2.7μm）上，置于半固体适配器（规格1.2mL）中，放入装入内径22.6 mm的标准片剂池中（薄膜朝下），用200 mL含0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化钠溶液作为释放介质，温度为（32±0.5）℃，脉冲为120，活塞泵流量为8，在16和32mL/min下测量。 0、2、4、8、12、18、24、30、36、42、48小时后取样1.5mL，取溶液按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算释放量，并绘制释放曲线，研究流量对释放度的影响，结果见图6~7。 结果表明，随着流速的增加，同一时间内药物的释放量显着增加。 当流速为8 mL/min时，两种活性成分均无法在48 h内达到释放平台； 当流速为32 mL/min时，药物释放量显着增加。 min，释放速度较快，只有2分释放率低于85%； 在 16 mL/min 下，4 个点的释放率低于 85%。 为了更好地计算释放曲线相似因子并评估不同产品体外释放曲线的差异，本研究选择流速为16 mL/min，以建立更具辨别力的体外释放方法。

表5 放置方法

图3 标准片池中添加玻璃珠示意图

图4 曲安奈德不同加载方式下的释放曲线

图5 硝酸益康唑在不同加载方式下的释放曲线

3.3.4 半透膜孔径的选择

照溶出度和释放度测定法（中国药典第四部通则0931第六法，2020年版）测定。 采用流通池法封闭系统装置，取本品约0.1g，均匀涂抹于孔径分别为0.7、2.7μm的半透膜上，置于半固体适配器（规格1.2）中。 mL），放入内径为22.6 mm的标准件池中（膜朝下），用200 mL含0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化钠溶液作为释放介质，温度为（32± 0.5)℃，脉冲120，流速16mL/min。 分别于0、2、4、8、12、18、24、30、36、42、48小时取样1.5mL，取溶液按“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，并计算释放量。 绘制释放曲线，研究玻璃纤维膜孔径对释放的影响。 结果如图8~9所示。 结果表明，半固体衔接半透膜的孔径大小对该产品的释放速率影响较大。 当膜孔径较小时，活性成分无法有效释放，因此半透膜孔径确定为2.7μm。

图6 曲安奈德不同流量下的释放曲线

图7 硝酸益康唑在不同流量下的释放曲线

图8 曲安奈德在不同孔径半透膜中的释放曲线

图9 不同半透膜孔径下硝酸益康唑的释放曲线

3.4 体外释放测定

取A、B两个厂家的样品约0.1g，按“3.1.2”分别测定0、2、4、8、12、18、24、30、36、42、48小时。 取样品1.5 mL，按“3.1.1”中的色谱条件测定溶液。 记录色谱图，计算释放量，绘制释放曲线，比较两个不同厂家体外释放曲线的差异。 结果见表6~7和图10~11。结果表明，®和®两种活性成分的溶出曲线存在显着差异。

表6 不同厂家曲安奈德释放度测定结果

表7 不同厂家硝酸益康唑释放量测定结果

04 讨论

4.1 色谱条件的选择

本研究以2020年版《中国药典》曲安奈德益康唑乳膏含量测定方法为基础，建立了体外释放度测定方法[9]。 由于本研究未能获得两家制造商的所有辅料，因此特异性尚不清楚。 空白赋形剂溶液可检验，但供试品溶液中两个主峰的纯度角均小于纯度阈值，说明两个主峰较纯，赋形剂不干扰测定。 该方法准确度好、灵敏度高，可以准确检测低或高浓度水平，并具有评估两种主要成分释放速率变化的能力。

图10 不同厂家曲安奈德释放曲线

图11 不同厂家硝酸益康唑释放曲线

4.2 释放介质的选择

由于曲安奈德和硝酸益康唑均极难溶于水，因此必须选择合适的介质以同时满足两种活性成分的下沉条件。 李珍等. ［8］以0.9%氯化钠注射液-无水乙醇（50:50，V/V）为接收液，采用Franz扩散池考察本品的体外透皮吸收情况。 测定值显着高于0.9%氯化钠注射液。 由于本研究中的SOTAX流动池溶出仪没有配备耐有机相的标准池，因此在释放介质检查时添加表面活性剂，检查表面活性剂的类型和浓度，以增加药物的溶解度在介质中。 结果表明，选择含0.05%十二烷基硫酸钠的0.9%氯化钠溶液作为释放介质，能够满足两种活性成分的渗漏条件。 使用闭环装置系统可以满足测量要求并避免需要开环装置。 大型媒体需求的缺点。

4.3 放置方式的选择

流式细胞法根据制剂的特点配备相应的样品池，包括标准片剂细胞（内径分别为12毫米和22.6毫米）、半固体适配器、植入细胞等。对于半固体制剂，常用的放置方法有标准片剂池和半固体适配器。 本研究考察了三种放置方法，结果表明：①在标准片剂池底部添加玻璃珠的放置方法。 玻璃珠可以使溶剂形成层流状态，因此释放更温和。 ②当半固体适配器置于标准片剂池中时，药物需要透过半固体适配器的玻璃纤维膜，然后溶解在释放介质中，因此释放最慢。 本研究确定半固体适配器作为释放测量的放置方法，以避免因样品位置和高度差异导致的RSD大的问题。

4.4 流量选择

流动池方法中的流速是影响药物溶出行为的重要参数。 各国药典中的标准流速为4、8、16mL/min。 目前常用的流速为 16 mL/min。 本研究检查了不同的流速，以确定具有一定判别力的释放条件。 结果表明，相同释放时间内，释放量随着流速的增加而增加，最终确定流速为16 mL/min，不仅能在一定时间内有效释放两种有效成分，还要有辨别能力。

4.5 过滤装置膜的选择

此外，流通池还配有过滤装置，以获得澄清的样品溶液用于含量测定。 但所使用的滤膜应是惰性的，不能明显吸附溶液中的活性成分。 本研究使用0.45μm混合纤维素膜和0.45μm尼龙滤膜来检查释放行为。 结果表明，使用0.45 μm尼龙滤膜时，硝酸益康唑48 h累积释放量约为80%，无法有效释放。 因此，请确保过滤装置是0.45μm的混合纤维素膜。

4.6 释放行为差异分析

本文两家生产企业的体外释放结果表明，与®和®的曲安奈德释放曲线相比，相似因子f2（选取10个点）为22.1，差异因子f1（选取10个点）为57.7，比较硝酸益康唑的释放曲线，相似因子（f2）为20.4，差异因子（f1）为57.1，表明两者的释放曲线存在显着差异。 ® 两种活性成分的释放速度明显快于 ®。 。 经过分析硫酸钠溶解度，® 和 ® Q1、Q2 和 Q3 之间存在显着差异。 Q3结果显示，虽然®的乳液液滴尺寸（5.71μm）大于®的乳液液滴尺寸（2.55μm），但®活性成分的粒径（32.36μm）明显小于® (149.82 μm)，表明活性物质的粒径可能是影响释放差异的主要因素之一。

05 结论

本文作者对曲安奈德益康唑乳膏的释放度试验进行了初步研究，选择了一种区分能力较好的流动池体外释放度测试方法，可用于该产品的质量控制，指导处方和工艺。研究。 初步研究结果表明，本品推荐使用法国上市的Cilag®作为参比制剂（药品，RLD）进行一致性评价。 但本次研究中并无该参比制剂，因此市售产品与RLD体外释放行为的差异仍需进一步研究，为国内生产企业对该品种的一致性评价提供数据支持。

06 参考文献

轻微地

如需原文请联系编辑（代理老师）

华融DS-7CP流通池溶出系统操作演示