基于聚乙二醇沉淀法分离外泌体分离技术的方法

本发明属于外泌体分离技术领域，具体涉及一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。

背景技术：

外泌体是活细胞在生理或病理条件下主动分泌到细胞外的膜囊泡。 它们携带蛋白质并运输RNA。 其内容物包括蛋白质、短链肽、DNA片段、磷脂和miRNA。 外泌体膜表面除了常见的标记物（如CD9、CD63、CD81等）外，还表达多种特异性标记物（如GPC1、GPC3、psma、epcam等）。 这些特定的外泌体高度反映了宿主细胞的类型和状态。 研究表明，特异性外泌体的分离和检测对于疾病诊断、治疗监测和预后判断具有重要意义，特别是在恶性肿瘤的诊断中，具有较高的诊断特异性和敏感性。

基于聚乙二醇的外泌体沉淀法是继超速离心之后应用最广泛的方法，占已发表论文的25%以上。 聚乙二醇可以与疏水性蛋白质和脂质分子结合并共沉淀，导致难溶性分子或外泌体降低其溶解度并在聚乙二醇溶液中沉淀。 该方法通常通过低速离心进行外泌体沉降沉淀法，以减少样品与聚乙二醇溶液的混合。 目前，基于聚乙二醇的外泌体沉淀技术普遍存在难以克服的技术难点：纯度和回收率低、杂质蛋白量大、粒径不均匀、生物聚合物难以去除等。

因此，有必要提供改进的技术方案来克服现有技术中存在的技术问题。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法，减少了现有技术分离外泌体时存在的非外泌体蛋白和蛋白质。 其他杂质的共沉淀污染大大提高了外泌体的纯度和产量。

本发明的第一方面提供了一种基于改进的聚乙二醇沉淀方法分离外来体的方法。 外泌体分离方法包括：

(1)将液体样品在10,000~30,000g、37℃下离心5~15分钟，收集沉淀和上清液s1；

(2)将步骤(1)中的沉淀重悬于分离液中，混匀，加入dtt；

(3)将步骤(2)得到的液体在37℃下孵育5～15分钟，期间混合3～5次；

(4)将分离液加入到步骤(3)得到的液体中，混匀，37℃、10,000~30,000g离心5~15分钟，收集上清液s2；

(5)将步骤(1)得到的上清液s1和步骤(3)得到的上清液s2混合，然后加入包含的沉淀物，混合并在0~10℃放置1-12小时(可冷藏过夜) ;

(6)将步骤(5)得到的组分室温10,000~20,000g离心20~30分钟，弃上清，然后1,000~2,000g离心2~5分钟除去所有液体，得到外泌体。

通过上述技术方案，可以减少外泌体提取过程中非外泌体蛋白和其他杂质的共沉淀污染，大大提高外泌体的纯度和收率。

优选地，如上所述的基于改进的聚乙二醇沉淀法的分离外泌体的方法，其特征在于：所述的dtt的添加量为终浓度150〜 250毫克/毫升。 通过该技术方案，可以使外泌体充分分散并与非外泌体蛋白及其他杂质分离，从而有利于步骤（1）中沉淀的外泌体的收集。

优选地，上述基于改进的聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法中，所述分离液按照以下方法制备：将200～500mm蔗糖、3～20mm三乙醇胺混合并调节pH至7.6。 通过该技术方案，步骤（1）中沉淀的外泌体可以分散在分离液中，易于收集。

优选地，上述基于改进的聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法中，所含的沉淀液按照以下方法制备：将乙酸钠按照1:3~1:2的比例混合（份数为1:3~1:2）。重量）以获得弱碱性的钉溶液。 通过该技术方案制备的优化溶液可以中和外泌体表面的负离子，促进外泌体的聚集和沉降，收集更多的外泌体。 分离效率远远超过单一乙酸钠溶液或目前市场上常用的。 。

优选地，在上述基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法中，沉淀液的添加体积需要使得最终浓度为8-10％(mg/ml)。 通过该技术方案，外泌体可以充分聚集和沉淀。

优选地，上述的基于改进的聚乙二醇沉淀法的分离外泌体的方法中，步骤（2）所述的分离液与步骤（4）所述的分离液的体积比为1〜3:1〜 5. 通过该技术方案，步骤(1)中沉淀的外泌体能够充分分散在上清液s2中。

优选地，上述基于改进的聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法中，步骤（1）所述的液体样品与步骤（2）所述的分离液的体积比为1〜50:1〜 3. 通过该技术方案，步骤(1)中沉淀的外泌体能够充分分散在上清液s2中。

本发明的第二方面提供了通过前述基于改进的聚乙二醇沉淀法的用于分离外泌体的方法获得的外泌体。

本发明的第三方面提供了根据上述方法获得的外泌体在生物或医学领域中的应用。

本发明的有益效果：本发明通过改进基于聚乙二醇沉淀的外泌体分离方法，减少了现有技术分离外泌体时存在的非外泌体蛋白及其他杂质的共沉淀污染。 外泌体的纯度和产量大大提高。

附图说明

为了更加清楚地说明本发明的技术方案，下面对实施例中所需使用的附图进行简单介绍。 应当理解，以下附图仅示出了本发明的一些实施例，因此不应理解为对本发明范围的限制。 对于本领域普通技术人员来说，基于这些附图，在不付出创造性劳动的情况下，还可以得到其他相关附图。

图1显示了-blot实验的结果；

图2为透射扫描电子显微镜（TEM）检测外泌体形态的结果；

图3为改进PEG法、普通PEG法的NTA检测对比及采集颗粒数分布情况；

图4为超速离心法和免疫磁珠法进行NTA检测收集的颗粒数量分布；

图5为外泌体纯度对比，其中1为超速离心法，2为免疫磁珠法，3为普通PEG法，4为试剂盒，5为改进的PEG法。

详细方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照国家标准测定。 没有相应国家标准的，按照一般国际标准、常规条件或者制造厂推荐的条件。

本发明中提到的特征或实施例中提到的特征可以被组合。 本说明书中公开的所有特征可以以任何组合形式使用，并且本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或相似目的的任何替代特征所替代。 因此，除非另有说明，所公开的特征仅是等同或相似特征的一般示例。

本发明中，除非另有说明，所提及的所有实施例及优选实施例可以相互组合，形成新的技术方案。

在本发明中，除非另有说明，本文所提及的所有技术特征和优选特征可以相互组合，形成新的技术方案。

本发明中，除非另有说明，所提及的所有实施例及优选实施例可以相互组合，形成新的技术方案。

在本发明中，除非另有说明，本文所提及的所有技术特征和优选特征可以相互组合，形成新的技术方案。

为使本发明的技术手段、创造性特征、达到的目的和效果更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明包括但不限于这些实施例。

实施例1.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法，包括以下步骤：

步骤一、主液配制：

(a) 分离液：250mm蔗糖，10mm三乙醇胺，调节pH至7.6；

(b)沉淀：将乙酸钠按1:3(重量份)的比例溶解，得到弱碱性的PEG溶液。

步骤2.外泌体分离操作：

(1) 收集1ml样品（血浆）于无菌管中，37℃、17,000g离心10分钟，收集沉淀和上清液s1；

(2)将步骤(1)中的沉淀重悬于1ml分离液中，混匀，加入适量dtt(终浓度200mg/ml)；

(3)将步骤(2)得到的液体在37℃下孵育10分钟，期间混合3-5次；

(4)向步骤(3)得到的液体中加入2ml分离液，混匀，37℃、离心10分钟，收集上清液s2；

(5)将上清s1和s2混合后，加入沉淀至终浓度9%(mg/ml)，混匀，4℃放置1小时；

(6) 室温15,000g离心30分钟。 白色外泌体将会沉淀。 弃去上清液并以 1,500g 离心 5 分钟。 小心去除所有液体以获得所需的外泌体；

根据后续检测的需要，可加入适当体积的不同检测液重悬外泌体备用。

实施例2.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法，包括以下步骤：

步骤一、主液配制：

(a) 分离液：200mm蔗糖，20mm三乙醇胺，调节pH至7.6；

(b)沉淀：将乙酸钠按1:2(重量份)的比例溶解，得到弱碱性的PEG溶液。

步骤2.外泌体分离操作：

(1)收集10ml样品(血浆)于无菌管中，37℃、30,000g离心5分钟，收集沉淀和上清液s1；

(2)将步骤(1)中的沉淀重悬于3ml分离液中，混匀，加入适量dtt(终浓度250mg/ml)；

(3)将步骤(2)得到的液体在37℃下孵育5分钟，期间混合3-5次；

(4)向步骤(3)得到的液体中加入5ml分离液，混匀，37℃、离心15分钟，收集上清液s2；

(5)将上清液s1和s2混合后，加入沉淀使终浓度为10%(mg/ml)。 混合后，0℃放置12小时（可冷藏过夜）；

(6) 室温20,000g离心20分钟。 白色外泌体将会沉淀。 弃去上清液并以 2,000g 离心 2 分钟。 小心去除所有液体以获得所需的外泌体；

根据后续检测的需要，可加入适当体积的不同检测液重悬外泌体备用。

实施例3.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法，包括以下步骤：

步骤一、主液的配制：

(a) 分离液：500mm蔗糖，3mm三乙醇胺，调节pH至7.6；

(b)沉淀：将乙酸钠按1:2.5(重量份)的比例溶解，得到弱碱性的PEG溶液。

步骤2.外泌体分离操作：

(1)收集6ml样品(血浆)于无菌管中，37℃、10,000g离心15分钟，收集沉淀和上清S1；

(2)将步骤(1)中的沉淀重悬于1.8ml分离液中，混匀，加入适量dtt(终浓度150mg/ml)；

(3)将步骤(2)得到的液体在37℃下孵育15分钟，期间混合3-5次；

(4)向步骤(3)得到的液体中加入1ml分离液，混匀，37℃、离心5分钟，收集上清液s2；

(5)将上清液s1和s2混合后，加入沉淀至终浓度8%(mg/ml)，混匀，10℃放置2小时；

(6) 室温10,000g离心30分钟。 白色外泌体将会沉淀。 弃去上清液并以 1,000g 离心 5 分钟。 小心去除所有液体以获得所需的外泌体；

根据后续检测的需要，可加入适量不同检测液重悬外泌体备用。

实施例4.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例1不同的是，步骤二中的样品为尿液。

实施例5.一种基于改良聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例2不同的是，步骤2中的样品为尿液。

实施例6.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例3不同的是，步骤2中的样品为尿液。

实施例7.基于改​​进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例1不同的是，步骤二中的样本为唾液。

实施例8.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例2不同的是，步骤2中的样本为唾液。

实施例9.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例3不同的是，步骤2中的样本为唾液。

实施例10.一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例1不同的是，步骤2中的样品为细胞培养上清液。

实施例11.一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例2不同的是，步骤2中的样品为细胞培养上清液。

实施例12.基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法

本实施例主要描述一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法。 与实施例3不同的是，步骤2中的样品为细胞培养上清液。

实施例13.外泌体分离和检测与现有外泌体分离方法的比较

外泌体提取常用的方法有超高速离心、免疫磁珠分离、普通PEG沉淀、试剂盒等。 除超高速离心和免疫磁珠分离外，其他方法均以PEG沉淀法为核心技术。

采集健康人血清3ml（同一样本采集5份），采用实施例1所述方法（即图1所示改进的PEG法），超高速离心，免疫磁珠分离，普通PEG沉淀法，试剂盒()中描述的方法分离外泌体，然后进行-blot检测(-blot检测使用本文描述的方法，..[j].,2017,17) ，得到如图1所示的结果。 实验数据。 实验结果表明，采用实施例1所述的方法(即图1所示的改进的PEG方法)成功分离出外泌体。

本例中采用超高速离心分离外泌体，如文献(,,.[j].,2014,3:25011.)所述，采用免疫磁珠分离外泌体，如专利([发明公开】采用免疫磁珠从血清中分离外泌体的方法，申请公开号：)方法，采用普通PEG沉淀法分离外泌体，如文献(,,.n-ng.[j]中所述。 ]., 2016, 141:4640-6.)方法，试剂盒()采用文献(,,.--.[j]., 2016,7:67387-67402.)中描述的方法分离外泌体。 ）。

还使用实施例2至12的方法分离外泌体，并获得与图1类似的实验结果。

实施例14、现有外泌体分离方法获得的外泌体形态和数量的对比实验

采集健康人血清3ml（同一样本采集5份），采用实施例1所述方法（即图2所示改进的PEG方法），超高速离心，免疫磁珠分离，普通PEG沉淀法、试剂盒()中描述的方法分离外泌体，然后使用透射扫描电子显微镜(TEM)检测外泌体的形态。 得到如图2所示的实验数据。 图中的箭头表示外泌体。 实验结果表明，与其他提取方法相比，实施例1所述的方法(即图2所示的改进的PEG方法)提取的外泌体背景更干净、数量更多。

还使用实施例2至12的方法分离外泌体，并获得与图2类似的实验结果。

实施例15、现有外泌体分离方法获得的外泌体的nta检测对比实验

采集健康人血清3ml（同一样本采集5份），采用实施例1所述方法（即图3所示改进的PEG方法），超高速离心，免疫磁珠分离，普通PEG沉淀法，试剂采用Box()中描述的方法分离外泌体，然后进行(nta)分析(具体技术参数请参见,,..[j].,2017,17)比较，得到的结果如图3和图4所示的实验数据。 实验结果表明，采用实施例1所述的方法(即图3所示的改进的PEG方法)、普通PEG方法和分离的外泌体进行NTA分析后，主峰均落在100-150nm区间内，而改进的PEG方法收集的颗粒比例在100nm附近更高（如图3所示）。 其他三种方法使用peg沉淀法收集的外泌体数量远高于超速离心和免疫磁珠法（如图4所示）。

同样采用实施例2至实施例12的方法分离外泌体，得到与图3和图4类似的实验结果。

实施例16、现有外泌体分离方法获得的外泌体提取纯度比较

采集健康人血清3ml（同一样本5份），分别采用实施例1所述方法（即图5所示5份）、超高速离心、免疫磁珠分离、普通PEG沉淀法、试剂盒采用（ ）分离外泌体，然后进行外泌体纯度分析对比实验，如图5（其中1为超速离心法，2为免疫磁珠法，3为普通PEG法，4为试剂盒，5为改良PEG法实验数据）。 外泌体的提取纯度定义为外泌体颗粒总数与总蛋白量的比值。 其中，外泌体颗粒总数由nta结果计算，总蛋白由bio-rad测定。 实验结果表明，采用实施例1所述的方法（即图5所示的改进peg法）提取的外泌体数量与提取物总蛋白量的比例最高，即纯度最高。最高。

还使用实施例2至12的方法分离外泌体，并获得与图5类似的实验结果。

本发明通过改进基于聚乙二醇沉淀的外泌体提取方法，减少了现有技术分离外泌体时存在的非外泌体蛋白及其他杂质的共沉淀污染。 纯度和收率大大提高。

以上已经示出并描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。 本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于上述实施例。 以上实施例及描述仅说明了本发明的原理。 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本发明还可以具有其他方面。 各种变化和修改是可能的，这些变化和修改都落入所要求保护的本发明的范围内。 本发明的保护范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特点：

1.一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法，其特征在于，所述外泌体分离方法包括：

(1)将液体样品在10,000~30,000g、37℃下离心5~15分钟，收集沉淀和上清液s1；

(2)将步骤(1)中的沉淀重悬于分离液中，混匀，加入dtt；

(3)将步骤(2)得到的液体在37℃下孵育5～15分钟，期间混合3～5次；

(4)将分离液加入到步骤(3)得到的液体中，混匀，37℃、10,000~30,000g离心5~15分钟，收集上清液s2；

(5)将步骤(1)得到的上清液s1和步骤(3)得到的上清液s2混合，然后加入包含的沉淀物，混合并在0~10℃放置1-12小时(可冷藏过夜) ;

(6)将步骤(5)得到的组分室温10,000~20,000g离心20~30分钟，弃上清，然后1,000~2,000g离心2~5分钟除去所有液体，得到外泌体。

2.根据权利要求1所述的基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体的分离方法，其特征在于，所述dtt的添加量为终浓度150～250mg/ml。

3.根据权利要求1所述的基于改进的聚乙二醇沉淀法分离外泌体的方法，其特征在于，所述分离液按照以下方法制备：200~500mm蔗糖、3~20mm三乙醇胺混合，调节pH至7.6。

4.根据权利要求1所述的基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体的分离方法，其特征在于，所含的沉淀物由以下方法制备：乙酸钠按1:3〜的比例溶解于溶液中。 1：2（重量份），得到弱碱性的PEG溶液。

5.根据权利要求1所述的基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体的分离方法，其特征在于，所述方法中所含沉淀物的添加体积使得最终浓度为8-10%(mg/ml)。

6.根据权利要求1所述的基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体的分离方法，其特征在于，

步骤(2)所述的分离液与步骤(4)所述的分离液的体积比为1〜3:1〜5。

7.根据权利要求1所述的基于改良聚乙二醇沉淀法的外泌体的分离方法，其特征在于，

步骤(1)所述液体样品与步骤(2)所述分离液的体积比为1～50:1～3。

8.通过根据权利要求1至7中任一项所述的基于改进的聚乙二醇沉淀方法的分离外泌体的方法获得的外泌体。

9.根据权利要求8获得的外泌体在生物或医学领域中的应用。

技术概要

本发明提供了一种基于改进的聚乙二醇沉淀法的外泌体分离方法，包括以下步骤：（1）将目标液体样品离心沉淀，收集沉淀物和上清液S1； (2)合并步骤(1)分离液中的沉淀物，混匀，加入DTT； (3)将步骤(2)得到的液体孵育并混匀； (4)将分离液加入到步骤(3)得到的液体中，混匀，重复离心，收集上清液S2； (5)将上清液S1和上清液S2混合，加入沉淀，混匀，置于0~10℃； (6)高速离心与低速离心相结合，去除上清液，得到外泌体。 本发明的外泌体分离方法减少了现有技术分离外泌体时存在的非外泌体蛋白及其他杂质的共沉淀污染，大大提高了外泌体的纯度和收率。

技术研发人员：王成； 董明; 张弓

受保护技术使用者：诚启医疗（深圳）科技有限公司

技术研发日：2020.03.23

技术公告日期：2020.05.08