菌 ⑴稀释摇管法稀释倒平板法（皿法）

稀释摇管法是稀释和倾注平板法的改进形式。 首先，将一系列装有无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化，并保持在约50°C。 将稀释成不同梯度的菌液连续添加。 将液体倒入融化的琼脂试管中，快速充分混合。 冷凝后，在琼脂柱表面倒一层灭菌的液体石蜡和固体石蜡混合物，尽可能将培养基与空气隔离。 孵育后，菌落在琼脂柱的中高处形成。

困难在于挑选菌落。 首先，需要用消毒针去掉覆盖的石蜡帽，然后在琼脂和管壁之间插入毛细管，吹入无菌无氧岩棉，取出琼脂。 吸干柱子，置于培养皿中，最后用无菌刀将琼脂柱切成薄片，以便观察和转移菌落。

该方法的缺点是菌落观察和挑取困难。 但在缺乏专业设备的情况下，该方法仍然是一种方便、有效、低成本的厌氧微生物分离、纯化和培养方法。

⑵叠盘夹层法

叠板夹心法的本质是将细菌夹在上下两层培养基之间，创造一个相对无氧的环境，使SRB能够在间隙中生长。

具体方法是利用无菌操作技术将已富集的菌液稀释成不同的浓度。 将含有2质量％琼脂的固体培养基融化，并保持在50℃左右。 在无菌条件下设置短装区域，将约1/3倒入培养皿盖（90mm×15mm）中。 固体培养基刚刚凝结后，吸取适量不同浓度的稀释液，迅速铺于平板上。 让稀释剂渗透约30秒后，将相同的营养固体培养基倒入培养皿中部。 按压底座直至突出物不溢出菌，然后快速盖上盘子并按下去。 培养皿中不应有气泡。

除去培养皿内外侧壁之间多余的琼脂，倒入适量融化的石蜡，使培养皿侧壁的缝隙用石蜡密封，尽量不留空气气泡。 培养一周后，添加二价铁离子的平板受精孔中就会生长出黑色SRB菌落。 将它们放在酒精灯旁边加热，以熔化固体石蜡结构。 由于上下层培养基的凝固时间不同，当取出内皿后，很容易用镊子夹起上层培养基，从而露出下层培养基中的菌落。 当需要挑取菌落时，可将其切成片，转移，然后捣碎至液体培养基中。

这种方法的优点是培养物通过在营养琼脂三明治中铺展或划线来生长。 挑取菌落时，可轻松定点挑取细菌。 同时，该方法不需要另外创建厌氧环境，因而省时省力，具备所有好氧、厌氧分离方法的优点。

⑶滚管术击打诗底去母术

滚管技术是培养厌氧菌的最佳方法。 滚管技术是1950年由美国微生物学家首先提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的厌氧培养技术。 这项技术经历了几十年的不断完善，使得亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套技术。 目前国内外许多专门从事厌氧培养的实验室大多采用该技术。

滚管技术是指在无菌、厌氧条件下，将适当稀释度的菌液放入装有琼脂培养基的厌氧试管中，然后置于滚管机或冰盘中。 在试管上均匀滚动，使细菌培养基均匀凝固在试管内壁上。 当琼脂在管壁周围完全凝固后，即可将琼脂试管垂直放置保存，并在底部浓缩少量的水。 培养几天后，即可见到厌氧状态。 收获管中的固体培养基内部和固体培养基表面均存在9个菌落。 挑选菌落也非常方便。 可以在酒精灯旁用自制的玻璃吸管接种针挑出生长状况良好的菌落，快速放入液体培养基中培养。

滚管技术的优点是培养基可以在厌氧管内壁形成均匀透明的薄层。 同时，菌落可以埋藏在培养基内部或在表面生长。 与平板涂布法相比，接触氧气较少。 机会就大大减少了。